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Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 12746 (2022) Citare questo articolo

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Dettagli sulle metriche

La caratterizzazione olografica totale (THC) è presentata qui come un metodo efficiente, automatizzato e privo di etichette per identificare accuratamente la vitalità cellulare. Il THC è una tecnologia di caratterizzazione di singole particelle che determina la dimensione e l'indice di rifrazione delle singole particelle utilizzando la teoria di Lorenz-Mie della diffusione della luce. Sebbene la valutazione della vitalità cellulare sia una sfida in molte applicazioni, inclusa la produzione di prodotti biologici, gli approcci tradizionali spesso includono un'etichettatura inaffidabile con coloranti e/o metodi dispendiosi in termini di tempo per il conteggio manuale delle cellule. In questo lavoro abbiamo misurato la vitalità del lievito Saccharomyces cerevisiae in presenza di varie concentrazioni di isopropanolo in funzione del tempo. Tutte le misurazioni del THC sono state eseguite nell'ambiente nativo del campione senza diluizione o aggiunta di etichette. Le misurazioni olografiche sono state effettuate con un microscopio olografico in linea utilizzando una lente obiettivo da 40\(\times\) con illuminazione ad onda piana. Abbiamo confrontato i nostri risultati con il THC con il conteggio manuale delle cellule vive e morte distinte con il colorante trypan blue. I nostri risultati dimostrano che il THC può distinguere efficacemente le cellule di lievito vive e morte in base all’indice di rifrazione delle singole cellule.

L'uso di cellule di lievito, in particolare di Saccharomyces cerevisiae, è onnipresente sia nell'industria che nel mondo accademico1,2,3 per applicazioni che vanno dagli esperimenti cellulari alla produzione di proteine. Ad esempio, nella ricerca medica il lievito funge da organismo modello per studiare le mutazioni genetiche rilevanti nel cancro4,5,6. Nella ricerca e nella produzione biofarmaceutica, le cellule di lievito vengono impiegate come mini-fabbriche per la produzione di proteine ​​di interesse7,8,9. Inoltre, in una delle applicazioni più note, il lievito viene utilizzato nella ricerca e nella produzione di prodotti di consumo per ottimizzare la produzione di birra, vino e pane10,11,12,13.

La vitalità cellulare è un parametro chiave di interesse in molte di queste applicazioni14. Sebbene esistano numerosi metodi per misurare la vitalità del lievito, la maggior parte condivide una limitazione: la necessità di colorare le cellule con un colorante. I metodi basati sui coloranti, come il test di esclusione del trypan blue (TB), si basano sul fatto che le membrane cellulari sane siano impermeabili al colorante mentre le membrane delle cellule morte o danneggiate consentono al colorante di diffondersi nella cellula15. Sebbene questo metodo sia utile, di solito comporta una noiosa preparazione del campione e un conteggio manuale delle cellule. Il conteggio manuale delle cellule soffre di statistiche basse ed è soggetto a errori umani. Inoltre, è stato dimostrato che il test di esclusione della tubercolosi sovrastima la vitalità ed è inaffidabile per alcuni campioni cellulari con una vitalità inferiore al 70%-80%16,17,18.

Inoltre, con qualsiasi misurazione della vitalità della colorazione basata su colorante, esiste il pericolo che il colorante possa interagire con le cellule o con un'altra variabile sperimentale in modi non desiderati. Ad esempio, è stato dimostrato che il trypan blu interagisce negativamente con le cellule, spesso rompendole e rendendo quindi inaffidabili le misurazioni della vitalità19. Sebbene i limiti dei test di vitalità basati su etichetta siano ben noti, esistono poche alternative senza etichetta20.

In questo lavoro introduciamo una tecnica automatizzata e senza etichetta per misurare in modo affidabile la vitalità del lievito utilizzando la caratterizzazione olografica totale® (THC). Il THC è una tecnologia, basata sulla videomicroscopia olografica, sviluppata per rilevare, contare e caratterizzare le particelle subvisibili in sospensione21. Qui abbiamo valutato la vitalità del lievito utilizzando xSight, che implementa il THC e combina la microscopia olografica con la gestione dei campioni microfluidici per fornire misurazioni precise della dimensione delle particelle e dell’indice di rifrazione. L'uso di chip campione microfluidici monouso garantisce che non vi sia contaminazione incrociata tra i campioni e che non sia necessaria alcuna pulizia. Ogni misurazione è automatizzata e richiede circa 15 minuti per essere completata.